IITC MRBP鼠尾血壓監測儀在參苓白術散對代謝綜合征大鼠胰島素抵抗研究應用

來自廣州中醫藥大學第二附屬醫院的蔡海榮團隊在《廣州中醫藥大學學報》發表了題為“參苓白術散對代謝綜合征大鼠胰島素抵抗、炎癥狀態的影響”的研究論文。該研究以SD大鼠為實驗對象，采用高脂高糖高鹽飼料喂養方法構建代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）大鼠模型，觀察參苓白術散對MS大鼠的治療效果，并探索其作用機制。

 摘要

【目的】探討參苓白術散對代謝綜合征（MS）大鼠的治療作用及機制。

【方法】將40只大鼠分為正常組（10只）和造模組（30只）。造模組大鼠采用高脂高糖高鹽飼料喂養方法構建MS模型。將造模成功的21只MS大鼠隨機分為模型組（7只）、中藥組（7只）、西藥組（7只），正常組納入大鼠9只。中藥組給予參苓白術散水煎液灌胃，西藥組給予鹽酸二甲雙胍生理鹽水溶液灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，治療時間為4周。給藥結束后，檢測大鼠體質量、腹圍、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、空腹血糖（FPG）、胰島素（FINS）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、脂肪酸（FFA），計算穩態模型評估的胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、肥胖指數、Lee‘s指數；酶聯免疫吸附分析（ELISA）檢測大鼠血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素8（IL-8）；實時定量聚合酶鏈反應（QPCR）法檢測肝臟NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、Toll樣受體4（TLR4）、核轉錄因子κB（NF-κB）mRNA表達；蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肝臟病理變化。

【結果】與正常組比較，模型組大鼠體質量、腹圍、肥胖指數、Lee’s指數、SBP、DBP、FPG、FINS、TC、TG、LDL-C、FFA、HOMA-IR、TNF-α、IL-1、IL-8水平均升高，HDL-C降低，肝臟NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達水平均升高，HE染色結果顯示肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤；中藥組上述各指標較模型組均得到改善（P < 0.05），且與西藥組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。

【結論】參苓白術散可以改善MS大鼠糖脂代謝障礙、胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤，其機制可能與抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-8釋放及炎癥反應相關基因NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA的表達，進而減輕炎癥狀態有關。

實驗材料與儀器

實驗動物：

40只SPF級6周齡雄性SD大鼠，體質量（180 ± 20）g

藥物：參苓白術散由黨參12 g、白術12 g、茯苓12 g、炙甘草12 g、山藥12 g、炒扁豆9 g、薏苡仁6 g、砂仁6 g、蓮子肉6 g、桔梗6 g、陳皮6 g組成。鹽酸二甲雙胍片

飼料：基礎飼料和高脂高糖高鹽飼料

主要試劑：

大鼠胰島素（FINS）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、大鼠游離脂肪酸（FFA）ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒、白細胞介素1（IL-1）ELISA試劑盒、白細胞介素8（IL-8）ELISA試劑盒、TRIzol總RNA提取試劑盒、HiScript II U+ One Step qRT-PCR、cDNA一鏈合成試劑盒

主要儀器

Applied Biosystems PCR儀、StepOnePlus™實時熒光定量PCR系統、UV-5100紫外可見分光光度計、C5080R高速冷凍離心機、BSA224S電子天平、IITC MRBP鼠尾血壓監測儀

IITC MRBP鼠尾血壓監測儀

實驗方法與過程

動物模型構建

40只大鼠適應性喂養7 d后，隨機分為正常組（10只）和造模組（30只），所有大鼠分籠單獨喂養。正常組大鼠給予基礎飼料喂養，造模組大鼠給予高脂高糖高鹽飼料喂養。所有大鼠自由飲水，造模時間12周。

造模成功判定標準

12周后根據以下標準判定造模是否成功：①體質量、②空腹血糖（FPG）、③收縮壓（SBP）或舒張壓（DBP）、④TG高于正常組大鼠平均值+1.4倍標準差，⑤HDL-C低于正常組大鼠平均值-1.4倍標準差，滿足①的基礎上滿足②③④⑤中任意2項即可判斷MS造模成功。第12周末，造模組死亡1只、8只造模不成功予以剔除，正常組1只胰島素水平過高予以剔除。

分組與給藥

造模成功的21只MS大鼠隨機分為模型組（7只）、中藥組（7只）、西藥組（7只），正常組9只作為正常組。根據大鼠與人藥物劑量換算方法，中藥組大鼠給予參苓白術散水煎液（生藥劑量10 g·kg?1·d?1）灌胃，西藥組大鼠給予鹽酸二甲雙胍生理鹽水溶液（劑量105 mg·kg?1·d?1）灌胃，正常組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，連續給藥4周。

標本采集

末次給藥后禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉后，經腹中線開腹后腹主動脈采血10 mL，3000 r/min離心（離心半徑為16 cm），取上清液，-80℃保存待測。取大鼠雙腎周脂肪組織，稱質量并記錄。取大鼠肝臟組織，-80℃保存待測。

一般狀態觀察與指標檢測

記錄大鼠精神狀態、活動、尿量、毛發等。電子天平測量大鼠體質量；軟尺測量大鼠腹圍和體長；無創血壓儀測量大鼠尾動脈血壓；計算Lee‘s指數 = 體質量（g）× 1000 / 體長（cm）；肥胖指數 = 腎周脂肪質量（g）/體質量（g）× 100%。血糖儀檢測FPG；ELISA法檢測大鼠血清FINS、FFA、TNF-α、IL-1、IL-8含量；生化分析儀檢測大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

QPCR法檢測mRNA表達

取肝臟組織，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行熒光定量PCR反應。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環。引物由廣州泰盛生物科技有限公司合成。采用2?ΔΔCt相對定量法計算各目的基因表達量。

HE染色觀察肝組織病理變化

將肝組織石蠟切片脫蠟至水。將切片入蘇木素染3 ~ 8 min，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗，入伊紅染液中染色1 ~ 3 min。脫水封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

實驗結果

一般狀態比較

正常組大鼠毛發濃密、色澤光亮，活潑好動，精神飽滿，反應靈敏，進食正常，排便無異味；模型組大鼠毛發稀疏，色澤晦暗，精神萎靡，反應遲鈍，倦怠懶動，進食增加，排便明顯異味；中藥組和西藥組大鼠毛發、精神、反應、進食和排便均較模型組好轉。

肥胖指標和血壓比較

與正常組比較，模型組大鼠體質量、腹圍、肥胖指數、Lee’s指數、SBP、DBP均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠上述各項指標均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，上述指標差異均無統計學意義（P > 0.05）。

糖代謝指標比較

與正常組比較，模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。

脂代謝指標比較

與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平均升高（P < 0.05），HDL-C水平降低（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平均降低（P < 0.05），HDL-C水平升高（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，血清TC、TG、LDL-C、FFA水平差異均無統計學意義（P > 0.05）。

血清炎癥指標比較

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8含量均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8含量均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。

肝臟NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達比較

與正常組比較，模型組大鼠肝臟NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達水平均升高（P < 0.05）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠上述mRNA表達水平均降低（P < 0.05）；中藥組與西藥組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。

肝臟組織病理變化比較

正常組大鼠肝索結構清晰，肝細胞排列緊密；模型組大鼠肝細胞廣泛脂肪變性，細胞腫脹，充滿脂質空泡，炎性細胞浸潤；中藥組和西藥組脂肪變性、炎性細胞浸潤均減輕。中藥組和西藥組脂肪變性、炎性細胞浸潤程度無明顯差異。

結論與討論

代謝綜合征（MS）由高血壓、高血糖、血脂異常和腹型肥胖組成。胰島素抵抗是MS的中心環節，且與炎癥密切相關。中醫理論中，MS屬于“痰濁”“肥胖”范疇，主要病機為脾虛痰濁。參苓白術散出自《太平惠民和劑局方》，具有健脾化濕功效。

本研究結果顯示，模型組大鼠體質量、腹圍、SBP、DBP、FPG、FINS、TC、TG、LDL-C均升高，HDL-C降低，HOMA-IR升高，提示MS大鼠模型構建成功，并伴高胰島素血癥。中藥組大鼠體質量、腹圍、肥胖指數、Lee’s指數、FPG、FINS、HOMA-IR、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C均降低，HDL-C升高；HE染色結果提示肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤減輕。參苓白術散可以減輕MS大鼠體質量、改善糖脂代謝和胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤。

本研究還發現，中藥組大鼠血清FFA濃度較模型組降低。FFA是脂肪代謝的中間產物，可以造成胰島素靶器官對胰島素敏感性降低，引起高胰島素血癥。參苓白術散可能通過減輕FFA含量來改善胰島素抵抗。

MS是一種低度的系統性炎癥狀態，往往伴隨著炎癥因子水平升高。NLRP3、TLR4、NF-κB通路介導TNF-α、IL-1、IL-8等炎性因子的生成，炎癥因子干擾IRS/PI3K信號轉導通路，導致胰島素抵抗。本研究結果顯示，中藥組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8和肝臟組織NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達較模型組降低，提示參苓白術散通過抑制NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA的表達減輕MS大鼠炎癥狀態。

綜上，參苓白術散可以改善MS大鼠糖脂代謝障礙、胰島素抵抗，減輕肝臟脂肪變性和炎性細胞浸潤，其機制可能與抑制炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-8釋放及炎癥反應相關基因NLRP3、TLR4、NF-κB mRNA表達，進而減輕炎癥狀態有關。

參考文獻

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